Fatores geneticos moduladores da gravidade clinica nas Beta-talassemias : o exemplo da proteina AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein)

Orientador: Fernando Ferreira CostaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: AHSP é uma proteína eritróide específica que apresenta afinidade de ligação com a-globinas, estabilizando essas moléculas e dessa forma, evitando a precipitação nos precursores eritróides e bloqueando danos celulares causados pela oxidação de cadeias globínicas. Camundongos portadores de P-talassemia com deleção do gene AHSP apresentaram maior precipitação de cadeias a-globinas nas hemácias e níveis acentuados de anemia. Estudos in vitro utilizando proteína recombinante demonstraram menor geração de espécies reativas de oxigênio quando a-globinas encontram-se estabilizadas pela AHSP. Com o objetivo de analisar a importância da proteína AHSP como modulador de gravidade clínica nas síndromes P-talassêmicas o gene AHSP foi analisado em amostras de DNA de pacientes com P-talassemia, atendidos pelo Hemocentro da Unicamp, e em amostras controles durante minha tese de mestrado. Durante estes estudos, três características do gene AHSP foram detectadas. Estas características do gene AHSP foram investigadas durante o desenvolvimento deste presente trabalho. Primeiro, um polimorfismo localizado no posição 12888 no gene AHSP, que leva a substituição de uma Asparagina na posição 75 por uma Isoleucina (N75I), foi identificado em uma paciente heterozigota para P-talassemia (Pj9/pA) com anemia grave e em processos transfusionais freqüentes. Outras duas famílias apresentaram o polimorfismo N75I. Entretanto, nestes casos a presença do polimorfismo no gene AHSP não se correlaciona claramente com a gravidade clínica. O sequênciamento de amostras de indivíduos controles de várias partes do mundo sugerirão uma baixa freqüência deste polimorfismo na população analisada. Estudos de indivíduos saudáveis positivos para o polimorfismo N75I demonstraram precipitação e oxidação de cadeias globínicas nas hemácias. Análises funcionais com proteína recombinante sugerem que a proteína AHSP N75I apresenta características de ligação com a-globínas normais, mas é menos eficiente em evitar geração de espécies reativas de oxigênio por estas cadeias globínicas. Estes efeitos, quando em conjunto com ?-talassemia poderiam resultar em anemia mais grave, demonstrando a proteína AHSP N75I como um modificador genético nas síndromes talassêmicas. Segundo, através de análises computacionais, nós identificamos uma estrutura secundária na região 3'-UTR do RNA mensageiro do gene AHSP. semelhante a um elemento responsivo a ferro (IRE), presente em todas as espécies que apresentam o gene AHSP. Várias evidências demonstraram que, mesmo não apresentando as características principais para a caracterização de um IRE, esta estrutura secundária do gene AHSP é reconhecido pelas proteínas reconhecedoras de IREs (IRPs) regulando a estabilidade da molécula de RNA mensageiro em resposta aos níveis de ferro: 1) Recuperação do RNA mensageiro do gene AHSP através da imunoprecipitacão das proteínas IRP1 e IRP2: 2) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP: mutações neste IRE levam à desestabilização constitutiva do RNA mensageiro; 3) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP em camundongos que apresentam excesso de ferro. Estes dados contribuem para o melhor entendimento de como IRE atípicos podem ainda ser funcionais e sugerem um mecanismo que poderia regular a estabilidade de cadeias globínicas de acordo com os níveis de ferro. Além disso, sugerem que o excesso de ferro, que ocorre em pacientes com (3-talassemia. podem ser determinante na gravidade da doença por, provavelmente, aumentar os níveis de a-globinas livres e precipitando nos precursores eritróides. E, em terceiro, através de busca de sítios de ligação de fatores de transcrição no gene AHSP, nós encontramos um elemento MARE localizado no final do segundo éxon. Estudos de imunoprecipitaçâo de cromatina demonstraram ligação dos fatores de transcrição Nrf2, Bachl e Maf ao elemento MARE do gene AHSP e regiões controle. Concluindo, estes resultados demonstraram pela primeira vez um polimorfismo no gene AHSP que produz uma proteína não completamente funcional que pode estar relacionada com gravidade à p-talassemia e, além disso, descrevem dois mecanismos inéditos da regulação da expressão do gene AHSP que podem ser importantes na regulação deste gene em outras doenças hematológicas e durante a eritropoieseAbstract: Alpha-hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is an erythroid-specific molecular chaperone that binds the cx-chains of hemoglobin, preventing their precipitation and deleterious effects. Loss of AHSP exacerbates a-globin precipitation and anemia in a murine model for p-thalassemia. In vitro, recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species (ROS) by a-globin. To further define the role of AHSP as a modifier of P- thalassemia, we analyzed AHSP sequence for mutations in a large population of (3- thalassemic and control subjects. From this genomic screening three interesting features of the AHSP gene were found. First, a single nucleotide change that converts asparagine 75 to leucine (N75I) was identified in a patient who was heterozygous for P-thalassemia (p39/(3A). She presented with an unusually severe anemia that required regular blood transfusion. Another two families were positive detected for the SNP N75I. but the presence of other known genetic modifiers for thalassemia in these families made hard to correlate clinical severity with AHSP. Of the unrelated control subjects tested just one (0.35%) contained the SNP N75I. Analysis of red blood cells from this subject revealed normal hemoglobin indices but a small number of Heinz bodies, suggesting a non-fully functional AHSP. Analysis of the biochemical properties of the recombinant mutant protein showed that the binding affinity of AHSP N75I for a- hemoglobin is normal. Importantly, compared to wild type AHSP, the N75I mutant protein exhibited significantly reduced capacity to inhibit ROS production by a-hemoglobin. Hence, AHSP N75I may be less effective at conferring protection from oxidative-mediated damage by free a-hemoglobin in erythrocytes. These effects, when coupled with P-thalassemia, could result in more severe anemia, implicating AHSP N75I as a potential genetic modifier. Second, by computational algorithms, we identified IRE-like stem-loop structures in AHSP mRNA of multiple species, yet the primary sequences deviate significantly from canonical IRE consensus sequences determined by studies of classical IREs, such as Transferring receptor and Ferritin. Several lines of evidence now show that the AHSP IRE binds IRPs to regulate mRNA stability in an iron-dependent fashion: 1) AHSP mRNA co-immunoprecipitates with IRPs. 2) AHSP mRNA is destabilized by iron in both erythroid and heterologous cells; disruption of the IRE renders the mRNA constitutively unstable. To study how iron regulates AHSP expression in vivo, we treated mice with iron dextran for 10 days and then examined AHSP mRNA in Terll9+ erythroid progenitors by RT-PCR. We found that short-term iron overload reduced AHSP mRNA levels. Our findings indicate that AHSP mRNA stability is regulated by iron via an atypical 3'-UTR IRE. These findings extend the potential repertoire for functional IREs that do not conform as the previously defined canonical consensus sequences. In addition, they provide a potential mechanism by which erythroid cells can regulate globin stability according to iron status. As such, iron overload, which occurs in patients with p thalassemia, might aggravate the disease by further elevating the levels of toxic free a globin. And third, by computation analysis of transcriptional sites, we found a potential MARE element located at the end of the second exon. Experiments of chromatin imunoprecipitation assay determined the binding of the transcript factor Nrf2, Bachl and Maf to the MARE element of AHSP gene, as well to the positive controls. Overall, these results demonstrated for the first time a polymorphism on AHSP gene that produce a non fully functional protein that might be correlated with severity in p-thalassemia and two new mechanisms that control the AHSP gene expression with potential implications in another hematological diseases besides thalassemias and closely connecting AHSP with erythropoiesisDoutoradoBiologia Estrutural, Celular, Molecular e do DesenvolvimentoDoutor em Fisiopatologia Medic

Estudo da expressão do gene AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein) na diferenciação de eritrocitos em cultura e em pacientes com Beta-talassemia

Orientador: Fernando Ferreira CostaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: As síndromes talassêmicas compreendem um grupo heterogêneo de doenças hereditárias em que existe urna redução no ritmo de síntese de urna ou mais cadeias polipeptídicas da hemoglobina.Nas ß-talassemias ocorre supressão total ou parcial da produção de cadeias ß. O estado homozigótico da maioria das variantes genéticas de ß-talassemia produz o quadro clínico da talassemia maior ou anemia de Cooley. Esses pacientes apresentam acentuada anemia e necessitam de transfusões sangüíneas regulares para sobreviverem. Os indivíduos heterozigotos para ß-talassemia apresentam, com raras exceções, apenas discreta anemia. Existem ainda alguns quadros clínicos não tão graves quanto à forma homozigótica clássica, geralmente não dependentes de transfusão, que são denominados de "talassemia intermediária". A baixa produção de ß-globina em ß-talassemia, com a síntese normal de ?-globinas resulta num excesso de cadeias a que são responsáveis pela eritropoiese não eficaz, danos à membranas de eritrócitos e redução da vida-média de células vermelhas. Recentemente foi descrita urna proteína que formaria um complexo estável quando ligado à a-globinas, evitando que estas sofressem oxidação e precipitação. Esta proteína foi denominada AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein). A caracterização da proteína foi feita em camundongos e, até a presente data, não são encontrados dados da expressão do gene em humanos. Durante o desenvolvimento deste trabalho foram feitas análises de expressão gênica durante a diferenciação eritróide humana e em pacientes com ß-talassemia, evoluções clínicas maior e intermediária e em indivíduos controles. Foram feitas também análises da seqüência de DNA na procura de polimorfismos ou mutações que pudessem estar relacionados com a modulação da expressão ou relacionados com a doença. A análise da expressão gênica durante a diferenciação eritróide em humanos, mimetizada por cultura de precursores eritróides em cultura de duas fases indica que o gene AHSP está sendo requerido durante toda a diferenciação celular, sugerindo que possivevelmente AHSP está sendo requerido para estabilizar cadeias-? para a formação de hemoglobina. Em pacientes com ß-talassemia,a expressão do gene AHSP está aumentada em pacientes com clínica lntermediaria quando comparados com pacientes com clínica Maior e controles, enquanto que a expressão de ?-globina não demonstra diferenças entre os grupos. Mas dados da razão da expressão do gene AHSP/a-globina demonstram que, quando comparados com os dados obtidos da cultura, os grupos provavelmente apresentam diferenças pelo fato de que ß-talassemia intermediária apresentar mais eritroblastos que os outros grupos, mostrando que possivelmente AHSP não apresenta relação com a evolução clinicaem ß-talassemias. As análises de polimorfismos demonstraram polimorfismos que podem estar relacionado com ß talassemia e uma mutação que pode estar alterando a estrutura protéica de AHSP e talvez contribuindo para a pior evolução clinica de pacientes heterozigotos para ß talassemia. Baseado nestes dados nós prevemos uma importante função deste gene durante a diferenciação eritróide normal, descrevemos polimorfismos que podem relacionar o gene AHSP com ß-talassemias na população estudada durante o desenvolvimento deste trabalho, descrevemos aqui a primeira mutação detectada no gene AHSP que possa mostrar uma possível relação desta proteína com a evolução clinica em ß-talassemia, mas uma importância concreta do gene AHSP na fisiopatologia da ß-talassemia ainda não está bem estabelecidaAbstract: Thalassemia syndromes are a heterogeneous group of heredity diseases in which there is a reduction in the synthesis of one or more hemoglobin chains. In ß-thalassemia there is a reduction or total suppression of the ß-globingene expression. The homozygous state of most ß-thalassemia genetic variants produces the clinic evolution of major thalassemia or Cooley's anemia. These patients present severe anemia and require regular blood transfusions in order to survive. Heterozygous individuaIs present, with exceptions, discrete anemia. There are some clinical evolutions, not as severe as the classic homozygous form, which are often blood transfusion independent, named ß-thalassemia intermedia. Lower levels of ß-globinin ß-thalassemia,with normal synthesis of ?-globin lead to an unbalanced globin synthesis and to an excessive production of ?-globin chains. This results in ineffectiveery thropoiesis, erythrocyte membrane damage and a shortened lifespan of red blood cells. Recently, a protein forming a stable complex when connected with ?-globin avoiding thus the deleterious effects of ?-globin precipitation and oxidation has been described. This protein has been denominated AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein) and its characterization has only been performed on mice. Until now no data regarding the expression in human genes has been found. The present study analyzed the gene expression of the AHSP gene during human erythroid cell differentiation and in major and intermedia homozygous ß-thalassemia patients and in controls. DNA analysis was performed in order to detect polymorphisms or mutations possibly related to expression modulation or to the disease. The gene expression analysis during human erythroid cell differentiation, reproduced by the culture of the erythroid precursor in two phases demonstrated that the AHSP gene is required during the entire cell differentiation, suggesting that AHSP may possibly be required to stabilizea-chains in order to form hemoglobin .In ß-thalassemic patients, the AHSP gene expression was increased in intermedia patients compared to major patients and controIs, however no difference regardinga-globin gene expression was demonstrated between the groups. Ratio data of the AHSP/a-globin gene expression demonstrated that, when compared with the cell differentiation data, the groups probably presented differences due to the fact that ß-thalassemia intermedia patients presented more erythroblasts than the other groups, suggesting that AHSP may not be related to the clinicalevolution of ß-thalassemia. The polymorphisms analyses showed some one that could be relationship with ß-thalassemia and a mutation that could be changing the AHSP structure an may contributing to a worse clinicevolution in patients heterozygous to ß-thalassemia. Based on these data we suggest that the AHSP gene plays an important role during normal erythroid differentiation, described some polymorphisms that could be relation AHSP gene with ß-thalassemia,described the first mutation on AHSP gene that could show a possible relation of the AHSP with the clinic evolution in ß thalassemia,but a real importance of the AHSP gene in ß-thalassemia pathophysiology is not clearlyMestradoBiologia Estrutural, Celular, Molecular e do DesenvolvimentoMestre em Fisiopatologia Médic

Engineered asparaginase from Erwinia chrysanthemi enhances asparagine hydrolase activity and diminishes enzyme immunoreactivity - a new promise to treat acute lymphoblastic leukemia

BACKGROUND: The treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) uses the biopharmaceutical l-asparaginase (ASNase) as the main medication. This drug, from bacterial origin (Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi), depletes l-asparagine (Asn) and secondarily l-glutamine (Gln – GLNase activity) from the bloodstream, leading leukemic cells to die by deprivation of Asn. The use of ASNase is limited by the high incidence of adverse effects, which collectively can specifically impair quality of life of patients. Its high toxicity caused by the product of the hydrolysis of amino acids and the formation of anti-ASNase antibodies often required treatment interruption, thus reducing the chances of cure and increasing the rates of disease relapse. RESULTS: In order to improve enzymatic activity, while reducing toxicity, we developed through directed evolution a double-mutant ASNase from Erwinia chrysanthemi (Erw_DM), which has specific activity for Asn 46% higher than the wild-type enzyme (Erw_WT). This makes it possible to reduce the amount of protein necessary for depletion of this amino acid and, consequently, the reduction of GLNase activity, considered toxic. In silico analysis showed that a lower number of epitopes was exposed, resulting in reduced recognition of the recombinant protein by antibody anti-ASNase observed in vitro assay. Furthermore, we observed the same cytotoxic profile for the MOLT-4 and REH ALL cell lines using 40% lower protein mass of Erw_DM to achieve the minimum enzyme activity required in the bloodstream during treatment. CONCLUSION: Altogether, our findings describe a potent and less immunogenic ASNase, an improvement that may alleviate treatment adverse effects developed in anti-ALL therapy. © 2021 Society of Chemical Industry (SCI)